清华新闻网5月31日电 CRISPR系统是一种存在于原核生物中的适应性免疫系统，用于抵御外来DNA的入侵。在长期的免疫防御斗争中，CRISPR系统已经演化成多种类型，其中，Cas9通过引导RNA（gRNA）切割外源DNA的特性被广泛研究和应用到基因编辑领域。Cas9系统具有多种亚型，如II-A、II-B和II-C，其中II-C型的Cas9的多样性最高。然而CRISPR-Cas9系统是否存在额外的机制以对抗病毒的免疫逃逸竞争尚且未知，通过挖掘并解析这些未知的机制，有助于进一步拓展我们对于CRISPR系统进化过程的了解并且进一步提升其基因编辑效率。

5月29日，英国上市公司官网365生命学院刘俊杰（Jun-Jie Gogo Liu）课题组联合北京大学生命学院白洋课题组和英国上市公司官网365生命学院陈春来课题组在《自然》（Nature）杂志在线发表了题为“CRISPR免疫增效子PcrIIC1增强细菌Cas9系统免疫能力”（Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity）的研究论文。

通过生物信息学分析，研究团队观察到一类新型关联基因（Novel-associated genes, NAGs），显著富集存在于较大蛋白体积的II-C型Cas9的基因簇中，并推测这些NAGs可能参与到Cas9介导的细菌免疫过程中。为了进一步探索Cas9和NAGs的关系，研究人员开发了一套结构生长轨迹分析方法（structural growth trajectory analysis, SGT analysis），通过预测1381个II-C型Cas9的蛋白结构，实现了对Cas9蛋白结构演变的量化和轨迹分析。通过分析，发现了较大蛋白体积的II-C型Cas9存在自身新功能结构域生长进化的趋势，呈现出三条不同的蛋白体积逐渐变大的进化轨迹。研究人员还发现与NAGs的协同作用富集在三条生长轨迹的终点，这可能说明在漫长的进化过程中，Cas9系统新功能结构域的插入和NAGs的出现具有一定的相关性。

图1.结构生长轨迹分析方法（左）和II-C型Cas9的生长轨迹图（右）

研究团队通过生化实验和冷冻电镜解析复合体结构表明，来自金黄色细菌属（Chryseobacteriumsp.）的CbCas9生长出了一个全新的增强Cas9活性的β-REC2结构域，以及一个全新的能够与其关联基因PcrIIC1互作的CTH结构域。通过蛋白间相互作用，2个CbCas9蛋白和2个PcrIIC1蛋白能够形成异源四聚体复合物。

图2.CbCas9基因簇构成（上）、CbCas9效应蛋白结构（左下）和CbCas9-PcrIIC1复合体结构（右下）

研究团队发现，PcrIIC1蛋白能够作为一种CRISPR免疫增效子（Pro-CRISPR），通过与CbCas9形成异源四聚体复合体增强其活性。CbCas9-PcrIIC1复合物表现出增强的DNA结合和切割活性，更广泛的前间隔序列邻近基序（PAM）兼容性，更强的DNA双链解旋能力以及对靶向序列互补错配（mismatch）的容忍能力。

图3.PcrIIC1增强CbCas9的DNA结合（a）、切割（b）、PAM兼容性（c）、DNA解旋（d）和错配容忍（e）能力

为了进一步探究PcrIIC1增强Cas9活性的具体机制，研究人员进一步通过结构解析发现，CbCas9-PcrIIC1复合物的能力增强来源于复合物中的两个CbCas9能够结合同一条长链DNA，通过更强的电荷相互作用，使得该复合物的DNA结合能力增强。并且，复合体中的两个CbCas9通过协同作用，使得长链DNA发生扭曲和变构，更容易被解旋，从而促进了CbCas9-PcrIIC1复合物的DNA干扰（interference）能力。同时，研究团队还发现，两个CbCas9能够对称地分别靶向长链DNA的两条单链上的靶标序列，从而提高其在基因组上搜寻靶标的效率。

最终，为了检验CRISPR免疫增效子PcrIIC1对CbCas9抗噬菌体免疫能力的影响，研究人员在大肠杆菌中进行了抗噬菌体实验。实验结果表明PcrIIC1显著提升CbCas9系统对噬菌体的抵抗，且如果破坏CbCas9与PcrIIC1的相互作用，会导致增强的免疫力丧失。以上结果说明CbCas9-PcrIIC1复合体的形成对整个CRISPR-Cas系统的免疫增强至关重要。

图4.PcrIIC1显著增强了CbCas9系统的细菌免疫活性

研究开发了一套基于结构的SGT进化轨迹分析，鉴定出II-C亚型Cas9的进化趋势，首次发现了一类新型的CRISPR免疫增效子可以通过二聚化Cas9效应器提升Cas9活性，这些结果不仅有助于我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，还为未来基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具的开发奠定了基础。

英国上市公司官网365生命学院刘俊杰副教授、北京大学生命学院白洋研究员和英国上市公司官网365生命学院陈春来副教授为论文通讯作者；英国上市公司官网365生命学院博士后张寿悦、2020级博士生孙奥、中国科学院遗传与发育生物学研究所2017级直博生钱景美和英国上市公司官网365生命学院2023级博士生林铄为论文共同第一作者。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组、北京生命科学研究所董梦秋课题组对研究给予了大力支持。研究得到国家重点研发计划、自然科学基金委、农业部、科学探索奖和英国上市公司官网365与北京大学的经费、资源支持。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07486-x

供稿：生命学院

编辑：李华山

审核：郭玲